Purificação de queratinase por sistema aquoso bifásico integrado à ultrafiltração
Autor: Luisa Sala (Currículo Lattes)
Resumo
Resíduos ricos em queratina são insolúveis e resistentes à degradação por diversas enzimas proteolíticas. Em decorrência disso, a biodegradação da queratina é restrita a certo número de micro-organismos, dentre os quais se destacam as bactérias do gênero Bacillus. As queratinases são proteases intra ou extracelulares produzidas por estes micro-organismos. Possuem inúmeras aplicações de interesse industrial, podendo ser empregadas na produção de peptídeos de queratina, na degradação de príons, na indústria farmacêutica, entre outras. A aplicação industrial da enzima queratinase demanda técnicas de purificação eficientes e passíveis de ampliação em larga escala. Dentre as técnicas de purificação passíveis de ampliação de escala e de baixo custo se destacam o sistema aquoso bifásico (SAB) e a ultrafiltração (UF). A presente dissertação foi dividida em dois artigos. No primeiro artigo, a purificação da enzima queratinase produzida por Bacillus sp. P45 foi maximizada utilizando duas etapas de SAB. Na primeira etapa de purificação, o sistema formado por 3% de polietilenoglicol 1500 Da, 23% de fosfato de potássio (pH 7,0) e 8% (m/m) de NaCl particionou a enzima para a fase de topo obtendo fatores de purificação na ordem de 4,4 vezes e recuperação enzimática de 87%. A fase de topo, contendo a enzima de interesse, foi submetida à segunda etapa do sistema aquoso bifásico. Este sistema foi composto por 36% fase de topo (1° etapa do SAB), 28% de sulfato de amônio, 36% (m/m) de tampão Tris-HCl (pH 7,0), a enzima foi particionada para a fase de topo, onde fatores de purificação na ordem de 5,6 vezes e recuperações de 90% foram obtidos. No segundo artigo, o SAB foi integrado à ultrafiltração/diafiltração, e avaliou-se a aplicação da enzima bruta e purificada em diferentes substratos proteicos solúveis e insolúveis. A enzima purificada por duas etapas de SAB seguida de diafiltração (design 2) apresentou fator de purificação na ordem de 6,1 vezes e recuperação enzimática de 56,3%. Durante o processo de diafiltração foi possível separar a enzima do polietilenoglicol. A enzima purificada pelo design 2 apresentou atividade ótima na temperatura de 50°C e foi capaz de catalisar com maior eficiência à degradação de diferentes substratos proteicos solúveis e insolúveis quando comparada à enzima bruta, justificando sua purificação.