Obtenção e caracterização da enzima ß-galactosidase submetida a diferentes processos: purificação, imobilização e altas pressões
Autor: Anna Rafaela Cavalcante Braga (Currículo Lattes)
Resumo
A aplicação de diferentes processos para maximizar o uso industrial dos bioprodutos tem sido alvo de diferentes grupos de pesquisa. A enzima β-galactosidase, em particular, tem uma grande importância, pois tem um enorme potencial de aplicação em vários campos, como alimentos, biorremediação, biossensores, diagnóstico e tratamento de doenças. O presente estudo engloba o uso de processos de purificação, imobilização e aplicação de altas pressões em β-galactosidase obtida a partir de Kluyveromyces marxianus e suas influencias nas propriedades enzimáticas. A enzima foi obtida por cultivo submerso, em meio previamente otimizado. Inicialmente, realizou-se o estudo de condições de purificação de β-galactosidase usando cromatografia de troca iônica em única etapa cromatográfica, variando os parâmetros da eluição: pH, modo de eluição, volumes de leito, sal para eluição da enzima. Treze ensaios foram realizados e o melhor resultado apresentou um fator de purificação de 8,2 vezes e uma recuperação de 95,1%, no qual o KCl se mostrou uma alternativa interessante como sal de eluição. Considerando esses resultados, foi realizada a caracterização enzimática e a verificação da produção de galacto-oligossacarídeos (GOS) pela enzima em diferentes graus de purificação. Os resultados mostraram a importância do processo de purificação, considerando a aplicação dessas enzimas. As enzimas purificadas mostraram uma maior temperatura ótima, bem como menores valores de Km, e, portanto, maior afinidade pelo substrato o-nitrofenil-β-D-galactopiranosideo (ONPG) que os extratos enzimáticos brutos para ambas as cepas. A produção de GOS também foi maior quando a síntese foi realizada com as enzimas purificadas, apresentando um aumento de mais de 30%. A imobilização da enzima e o uso de altas pressões também foram estudados. Durante o estudo da imobilização foi primeiramente realizada uma seleção de suportes e técnicas de imobilização para β-galactosidase. O suporte Eupergit ® C se mostrou como mais promissor. Portanto, foi realizado um planejamento experimental para incrementar sua eficiência de imobilização. O melhor resultado obtido alcançou eficiência de imobilização de 15,6%, aproximadamente 5 vezes melhor do que o resultado obtido nos estudos iniciais. Ainda foram realizadas cinéticas de ligação para avaliar a capacidade de ligação enzima/suporte, que levou a um aumento na eficiência de imobilização (22%). Na melhor condição a enzima pôde ser reutilizada por 3 ciclos de hidrólise sem perder sua atividade. Finalmente, o efeito do uso de fluidos pressurizados CO2, propano, n-butano e gás liquefeito de petróleo (GLP), na atividade e estabilidade da enzima β-galactosidase foi avaliado. O n-butano pressurizado foi o fluido que mais aumentou a atividade residual da enzima. Em termos de estabilidade de armazenamento, a enzima tratada por n-butano se manteve com a mesma atividade após 120 dias sob refrigeração, o que não foi observado nas enzimas tratadas com os outros fluidos estudados. Avaliando a caracterização da enzima, também se pôde observar um aumento na estabilidade térmica, através dos valores de meia-vida (t1/2) e a constante de desnaturação térmica (Kd), da enzima após a pressurização. Os processos aplicados, no geral, melhoram as propriedades da enzima em estudo demonstrando a importância da aplicação dos mesmos para ampliação do uso industrial de β-galactosidase.