Imobilização de Protease de Bacillus sp. P45 em diferentes suportes
Autor: Daiane Felix Reis (Currículo Lattes)
Resumo
As proteases (EC 3.4) são enzimas hidrolíticas que clivam ligações peptídicas nas proteínas e em fragmentos de proteínas e representam de 60 a 65% do mercado global das enzimas industriais. Embora o emprego dessas enzimas seja bastante difundido, sua aplicação pode ser limitada por fatores como seu elevado custo, instabilidade catalítica e a dificuldade de recuperação. No entanto, muitas destas restrições de uso podem ser evitadas pela utilização de enzimas imobilizadas. A imobilização é uma ferramenta interessante para melhorar a atividade e a estabilidade de enzimas, permitindo sua reutilização. Assim, este trabalho teve por objetivo avaliar as técnicas de imobilização de protease obtida a partir do cultivo de Bacillus sp. P45, avaliando-se as propriedades dos derivados imobilizados. A presente tese foi dividida em quatro artigos. No primeiro foi realizado um estudo preliminar para avaliar a viabilidade de imobilização da enzima protease. A imobilização ocorreu através de adsorção física, ligação iônica e covalente. O suporte quitosana ativada com glutaraldeído apresentou melhores resultados em relação à capacidade de adsorção (25,4 U/g de suporte) e a estabilidade operacional (4 ciclos). No segundo artigo, avaliou-se a imobilização multipontual utilizando o suporte glioxil-agarose, resultando em um derivado mais estável, com rendimentos de imobilização de 41,6% em 6 h e 42,1% em 24 h de ensaio, sendo que a capacidade de adsorção do suporte foi de 16,2 U/g. A temperatura e o pH ótimos foram de 30ºC e 9,0, respectivamente. Em todas as temperaturas estudadas o derivado foi mais estável em termos de Kd e meia-vida, quando comparado ao suporte de referência bromocianógeno (CNBr). No terceiro artigo, utilizou-se resinas de troca iônica no processo de imobilização. Os maiores rendimentos foram encontrados para os derivados SP Sepharose (80%) e CM Sepharose (77%). Na temperatura de 40ºC, o derivado SP Sepharose apresentou o maior valor de meia vida (3,09 h) e o derivado DEAE Sepharose apresentou valor de meia vida de 0,59 h na temperatura de 50ºC. Os valores de Km encontrados para os derivados SP Sepharose e DEAE Sepharose foram de 0,83 e 1,94 mg.mL-1, respectivamente. O quarto artigo abordou a maximização da imobilização dos suportes SP Sepharose e DEAE Sepharose. O derivado SP Sepharose foi mais estável em pH 6,0, com capacidade de adsorção de 33,83 U/g, e para o derivado DEAE Sepharose a estabilidade ocorreu em pH 8,0, com capacidade de adsorção de 22,23 U/g. Os maiores rendimentos encontrados foram de 62,0% em pH 6,0 e de 64,2% em pH 7,0 para SP Sepharose e de 62,5% em pH 8,0 e 62,3% em pH 7,0 para DEAE Sepharose. Na temperatura de 50ºC, o suporte SP Sepharose (pH 6,0) apresentou valor de meia vida de 1,09 h e o suporte DEAE Sepharose (pH 8,0) de 1,74 h. Os parâmetros termodinâmicos G* variaram de 86,38 a 88,43 kJ/mol para ambos derivados; H* encontrado foi de 101,66 e de 108,10 kJ/mol e S* 0,044 a 0,067 kJ/mol.K para DEAE Sepharose e SP Sepharose, respectivamente. Os valores obtidos para z foram 17,85 e 17,98ºC para os derivados SP Sepharose e DEAE Sepharose, respectivamente. Os valores de D, em horas, variaram de 92,47 a 1,57 para SP Sepharose e 144,81 a 5,80 para DEAE Sepharose.