Estabilidade e aplicação de protease P45 na hidrólise proteica de plasma de sangue bovino
Autor: Thais de Matos de Borba (Currículo Lattes)
Resumo
Proteases microbianas apresentam várias características que possibilitam muitas aplicações industriais e são responsáveis por aproximadamente 60% do mercado global de enzimas. Dentre suas aplicações, são utilizadas na obtenção de peptídeos, os quais dependendo do tamanho da cadeia e sequência de aminoácidos constituintes, podem exercer função bioativa. O objetivo geral do presente estudo foi maximizar o grau de hidrólise do plasma de sangue bovino através das condições de reação, visando a obtenção de peptídeos bioativos a partir de protease P45 estabilizada. Primeiramente, as propriedades catalíticas e estabilidade da protease P45 foram avaliadas em meio contendo líquido iônico (LI) e solventes orgânicos e na presença de cloreto de cálcio. O potencial de hidrólise da protease no meio binário líquido iônico-acetona (1:1 v/v) foi estudado para caseína de leite. A seguir, a protease na presença de 50 mmol/L CaCl2 foi aplicada na reação de hidrólise das proteínas do plasma de sangue bovino (PSB). As condições de hidrólise do PSB avaliadas foram o pré-tratamento do substrato (aquecimento a 50, 70, 90 °C e uso de banho ultrassônico com aquecimento a 50 °C), temperatura (35 a 55 °C) e concentração de proteínas do substrato (10 a 40 g/L), sendo fixados os demais parâmetros reacionais. Logo, o hidrolisado obtido das reações foi fracionado por ultrafiltração nas membranas de corte de 1, 5 e 10 kDa, para avaliar as atividades antioxidante, prebiótica, antimicrobiana e anti-hipertensiva. A protease previamente tratada no LI [Emim][Tf2N] apresentou incremento da atividade enzimática em quatro dos cinco solventes orgânicos testados. O meio reacional contendo acetona e o LI (1:1 v/v) foi mais estável que o meio contendo tampão Tris-HCl (pH 7,5), com aumento de 0,1 h para 2,4 h na meia vida a 55 ºC, porém a protease neste meio hidrolisou a caseína de leite com grau de hidrólise aproximadamente 1,4 vezes menor que o meio aquoso em 5,5 h. A presença de 50 mmol/L CaCl2 forneceu uma conformação estável e ativa à protease, os pré-tratamentos aplicados ao plasma não diferiram estatisticamente, sendo fixado o aquecimento a 50 ºC/20 min. A maximização do grau de hidrólise foi efetuada na temperatura de 40 °C e concentração de proteínas de 17,5 g/L, atingindo 39,0 ± 0,8% em 12 h. A atividade de captura do radical ABTS do hidrolisado não ultrafiltrado foi igual a 46,6 ± 1,3 µmol TE/g.L não diferindo estatisticamente da fração >10 kDa (F1), enquanto que o poder quelante do ferro foi mais efetivo nas frações de menor tamanho, igual a 93,0 ± <0,1%, para fração 1-5 kDa (F3), sem diferir estatisticamente da fração 5-10 kDa (F2). O hidrolisado e frações do plasma não apresentaram potencial antimicrobiano. A fração F1 promoveu o melhor crescimento de Bifidobacterium lactis BB- 12®, com potencial prebiótico. Na determinação da atividade anti-hipertensiva, a fração F2 apresentou inibição de 32,2 ± 0,6%. Desta forma, este estudo promoveu a maximização do grau de hidrólise do plasma de sangue bovino catalisada por protease estabilizada em cálcio, sendo obtidos hidrolisados proteicos que resultaram em peptídeos com atividade antioxidante, antihipertensiva e prebiótica.