Purificação de xilanases de Aureobasidium pullulans CCT 1261 e sua aplicação na produção de xilo-oligossacarídeos
Autor: Luiz Cláudio Simões Corrêa Junior (Currículo Lattes)
Resumo
Enzimas xilanolíticas estão envolvidas na hidrólise da xilana, sendo que as principais incluem as endo-beta-1,4-xilanases (xilanases) e beta-xilosidases. Estas podem ser aplicadas na bioconversão de materiais lignocelulósicos em produtos de valor agregado, como xilo-oligossacarídeos (XOs). Os XOs são oligossacarídeos que apresentam atividade prebiótica, sendo obtidos preferencialmente por hidrólise enzimática. A produção de xilanases por leveduras merece destaque, pois são secretadas enzimas com alta atividade de endoxilanases e baixa de beta-xilosidases, característica desejável para a produção de XOs. Técnicas de purificação podem ser aplicadas para separação destas enzimas, de forma a favorecer a produção de XOs pela atenuação da produção de xilose. Este trabalho teve por objetivo estabelecer um protocolo para purificação de xilanases de Aureobasidium pullulans, bem como caracterizar e aplicar o extrato enzimático purificado na produção de XOs. Os cultivos para produção da enzima foram realizados em frascos Erlenmeyer aletados com 147 mL de meio estéril (pH 7.0) contendo (g/L) farelo de arroz (61,9), extrato de levedura (1,5) e (NH4)2SO4 (3,6), além de 3 mL de inóculo. Os frascos foram mantidos sob agitação orbital (150 rpm) e a 28 °C por 72 h. As técnicas de purificação da enzima estudadas foram a precipitação com sulfato de amônio (NH4)2SO4 e etanol em diferentes concentrações, em um único estágio e de forma fracionada (dois ou mais estágios). A enzima purificada foi caracterizada em termos do pH e temperatura ótimo, efeito de íons metálicos na atividade, parâmetros cinéticos, estabilidade térmica e em relação ao pH. A produção de XOs foi realizada a 45 °C, 3 % (m/v) de xilana de faia, pH 4,5, relação enzima:substrato 200 U/g, 180 rpm, por 24 h. Nestas condições de hidrólise foi avaliado o efeito de íons Ca2+. A purificação da xilanase por precipitação fracionada (0-20 / 20-60 %) com (NH4)2SO4 foi mais eficiente, com fator de purificação (FP) 10,27 vezes e recuperação da atividade enzimática de 48,6 % que a precipitação fracionada com etanol (FP = 5,54 e recuperação da atividade enzimática de 43,01 %). A xilanase purificada exibiu temperatura e pH ótimos de 50 °C e 4,5, respectivamente. A constante de Michaelis-Menten para a enzima purificada foi de 74,9 mg/mL. A adição dos sais CaCl2, ZnCl2 e FeCl3 no meio reacional promoveu o aumento da atividade, sendo que o Ca2+ (10 mmol/L) destacou-se entre os demais pois aumentou a atividade da xilanase em 44 %. A xilanase purificada com sal apresentou maior estabilidade térmica a 45 °C e pH 4,5 com meia-vida (t1/2) de 169 h. Nestas condições e na presença de íons Ca2+ (10 mmol/L) a enzima foi ainda mais estável (t1/2= 231 h). Nas reações de hidrólise os teores de XOs totais (6,7 mg/mL) e a conversão da xilana em XOs (22,3 %) não apresentaram diferenças significativas (p>0,05) entre 2 e 24 h de processo. Os hidrolisados apresentaram composição majoritária de xilobiose, xilotriose e xilose. A adição de íons Ca2+ não contribuiu para o aumento do conteúdo de XOs totais nem para maior conversão de xilana em XOs, porém o hidrolisado apresentou menor conteúdo de xilose e maior de xilobiose em 24 h.